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Entendiendo Microscopios y Objetivos
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Entendiendo Microscopios y Objetivos

Componentes de Microscopios | Conceptos Clave y Especificaciones | Ejemplos de Aplicación de Microscopía Óptica

Microscope System

Un microscopio es un dispositivo óptico utilizado para formar la imagen de algún objeto en un ojo humano o en un dispositivo de video. Los primeros microscopios, compuestos de dos elementos, simplemente producían una imagen más grande del objeto bajo inspección que lo que el ojo humano podía observar. El diseño ha evolucionado a través de la historia del microscopio para incorporar múltiples lentes, filtros, polarizadores, divisores de haz, sensores, fuentes de iluminación y otros componentes. Para entender estos complejos dispositivos ópticos, hay que considerar los componentes del microscopio, sus conceptos clave y especificaciones, y aplicaciones.

Componentes de Microscopios

Un microscopio compuesto es uno que contiene elementos de múltiples lentes. Funciona de una manera similar a una simple lupa, la cual utiliza solo un lente para magnificar objetos pequeños para que el ojo humano pueda distinguir sus detalles. Con una simple lupa, el objeto es posicionado dentro de la longitud focal de un solo lente. Esto produce una imagen virtual, magnificada. Con un microscopio, un sistema de lente de relevo reemplaza a un solo lente; un objetivo y un ocular trabajan en tándem para proyectar la imagen del objeto al ojo, o al sensor – dependiendo de la aplicación. Hay dos partes de un microscopio que aumentan la magnificación del sistema: el objetico y el ocular. Esta parte del microscopio se necesita para producir la magnificación base. El ocular, situado cerca al ojo o sensor, proyecta y magnifica la imagen real y proporciona una imagen virtual del objeto. Los oculares típicamente producen una magnificación adicional de 10X pero esto puede variar de 1X - 30X. La Figura 1 demuestra los componentes de un microscopio compuesto. Adicionalmente, la Ecuación 1 demuestra como calcular la magnificación general del sistema.

Components of a Compound Microscope
Figura 1: Componentes de un Microscopio Compuesto

 

Equation 1 (1)

 

Eyepieces

Oculares

Cuando los microscopios fueron inventados, los oculares desempeñaron un papel importante en su diseño, ya que eran los únicos medios para ver realmente el objeto bajo inspección. Hoy en día, las cámaras analógicas o digitales se utilizan para proyectar una imagen del objeto en un monitor o una pantalla. Los oculares de microscopio consisten generalmente de un lente de campo y un ocular, aunque existen múltiples diseños que cada uno crea un campo de visión más grande que un diseño de elemento único. Para obtener una guía sencilla sobre cómo seleccionar el diseño adecuado, consulte Cómo Elegir El Ocular Correcto.

Iluminación

La iluminación en un microscopio es tan importante como seleccionar el ocular u objetivo adecuado. Es crítico elegir la iluminación correcta para obtener los resultados más concluyentes. Antes de decidir el tipo de configuración de iluminación con la que se trabajará, considera la configuración de la aplicación, el objeto bajo inspección y los resultados deseados.

Muchos microscopios utilizan la iluminación de contraluz en comparación con la iluminación de luz directa tradicional ya que esta última por lo general sobresatura el objeto bajo inspección. Un tipo específico de iluminación de contraluz usado en aplicaciones de microscopía es la iluminación Koehler. En la iluminación Koehler, la luz incidente procedente de una fuente de iluminación, como de una bombilla, inunda el objeto bajo inspección con luz desde atrás (Figura 2). Emplea dos lentes convexos: el lente colector y el lente condensador. Está diseñado para proporcionar brillo e iluminación uniforme en el plano del objeto y en el plano de la imagen donde la imagen producida a partir del objetivo es formada a través del ocular. Esto es importante ya que asegura que el usuario no este formando la imagen del filamento de la bombilla. Ya que la iluminación de contraluz inunda el objeto con la luz trasera, también denominada como iluminación de campo claro.

Koehler Illumination Setup
Figura 2: Configuración de Iluminación Koehler

 

La iluminación de campo claro requiere un cambio en opacidad a lo largo del objeto. Sin este cambio, la iluminación crea una mancha oscura alrededor del objeto. El resultado final es una imagen de contraste relativo entre partes del objeto y la fuente de luz. En la mayoría de los casos, excepto que el objeto sea extremadamente transparente, la imagen resultante permite que el usuario observe cada parte del objeto con cierta claridad o resolución. En casos donde la transparencia del objeto hace que sea difícil distinguir características usando iluminación de campo claro, se puede utilizar iluminación de campo oscuro.

Con la iluminación de campo oscuro, los rayos directos de luz no son enviados hacia el objetivo, sino que iluminan al objeto en un ángulo oblicuo. Es importante tener en mente que estos rayos siguen iluminando al objeto en el plano del objeto. La imagen resultante utilizando iluminación de campo oscuro produce gran contraste entre el objeto transparente y la fuente de luz. Cuando es utilizada en una configuración de microscopía, la iluminación de campo oscuro produce una fuente de luz que forma un cono invertido de luz que bloquea los rayos centrales de luz pero que aún permite que los rayos oblicuos iluminen el objeto. La figura 3 ilustra una muestra de configuración de iluminación de campo oscuro en la que el cono hueco de luz es la apertura numérica del objetivo. En comparación, no hay rayos bloqueados en una configuración de iluminación de campo claro. El diseño de la iluminación de campo oscuro obliga a la luz a iluminar el objeto bajo inspección, pero no a entrar al sistema óptico, haciéndolo mejor para un objeto transparente.

Darkfield Illumination Setup
Figura 3: Configuración para Iluminación de Campo Oscuro

 

Un tercer tipo de iluminación utilizado en microscopía es la epi-iluminación. La epi-iluminación produce luz sobre el objetivo. Como resultado, el objetivo y la fuente de epi-iluminación sustituyen la configuración de iluminación Koehler. Utilizando el objetivo para una gran sección de la iluminación hace la epi-iluminación muy compacta – el mayor beneficio de este diseño. La Figura 4 ilustra la configuración de la epi-iluminación que es utilizada frecuentemente en aplicaciones de fluorescencia. Para más información en microscopía de fluorescencia, vea Fluoróforos y Filtros Ópticos para Microscopía de Fluorescencia.

Epi-Illumination Setup
Figura 4: Configuración de Epi-Iluminacion

 

Objectives

Objetivos

Los objetivos permiten que los microscopios proporcionen imágenes reales, magnificadas y son, quizás, el componente más complejo en un sistema de microscopio por su diseño de múltiples elementos. Los objetivos están disponibles con magnificaciones en el rango de 2X – 200X. Están clasificados en dos categorías: el tipo de refracción tradicional y el de reflexión. Cada categoría está dividido en varios tipos: conjugados finitos e infinitos (corregido para infinito). Para elegir el objetivo adecuado, es importante conocer los beneficios de las diferentes categorías y tipos.

Objetivos: Refractivos

La categoría de objetivos más utilizada es la de refracción. En un diseño refractivo la luz transmitida por el sistema es refractada, o doblada, por los elementos ópticos. Cada elemento óptico es típicamente recubierto con antirreflejante para reducir las reflexiones traseras y mejorar la transmisión general de luz. Los objetivos refractivos son utilizados en aplicaciones de visión de máquina que requieren resolución de detalles extremadamente finos. Existen múltiples diseños de objetivos refractivos, cada uno utilizando diferentes configuraciones ópticas. Los diseños pueden variar de dos elementos en objetivos acromáticos básicos (un lente acromático y un lente menisco) a quince elementos en objetivos plano-acromáticos (Figura 5). Los objetivos plano-acromáticos son los más complejos, diseño de objetivo de gama alta con corrección cromática y de campo plano, realizada dentro del objetivo.

Apochromatic vs. Achromatic Objective Design
Figura 5: Diseño de Objetivo Apocromático (Izquierda) vs. Acromático (Derecha)

 

Objetivos: Reflexivos

Los objetivos reflexivos utilizan un diseño de base reflexivo o de espejo. A menudo se pasan por alto en comparación con sus contrapartes refractivas, aunque pueden corregir muchos problemas presentes en el segundo. Los objetivos reflexivos consisten de un sistema de espejos primario y secundario (Figura 6) para magnificar y relevar la imagen de un objeto bajo inspección. Edmund Optics® utiliza el diseño popular Schwarzschild, aunque otros diseños están disponibles. Ya que la luz es reflejada por superficies metálicas y no refractada por superficies de vidrio, los objetivos reflexivos no sufren de las mismas aberraciones que los objetivos refractivos y no necesitan diseños adicionales para compensar por estas aberraciones. Los objetivos reflexivos pueden producir una mayor eficiencia luminosa así como una mejor potencia de resolución para la obtención de imágenes con detalle fino porque el sistema depende principalmente del recubrimiento del espejo en lugar del sustrato de vidrio que se utiliza. Otro beneficio de los objetivos reflexivos es la posibilidad de trabajar más profundamente en las regiones espectrales ultravioleta (UV) o infrarroja (IR) debido al uso de espejos en comparación con la óptica refractiva convencional.

Anatomy of a Reflective Objective
Figura 6: Anatomía de un objetivo Reflexivo

 

Conceptos Clave y Especificaciones

La mayoría de las especificaciones de los objetivos de microscopio se enumeran en el objetivo en sí: el diseño del objetivo, la magnificación, apertura numérica, distancia de trabajo, distancia del lente a la imagen, y corrección del grosor del cubreobjetos. La Figura 7 muestra como leer las especificaciones del objetivo de microscopio. Ya que las especificaciones están localizadas directamente en el cuerpo del objetivo, es fácil saber exactamente lo que uno tiene, un dato muy importante al incorporar múltiples objetivos en una aplicación. Cualquier otra especificación, como la longitud focal, campo de visión, y longitud de onda del diseño, pueden ser fácilmente calculados o encontrados en las especificaciones proporcionadas por el proveedor o fabricante.

Typical Transmissive Microscope Objective
Figura 7: Objetivo de Microscopio de Transmisión Común

El Estándar del Objetivo

Si el objetivo sigue una norma de microscopio (como DIN o JIS) entonces se muestra en el cuerpo para mostrar cuales especificaciones requeridas deben estar presentes en el sistema. La mayoría de los microscopios compuestos utilizan el estándar Deutsche Industrie Norme, o DIN. El estándar DIN tiene una distancia de 160mm de la brida del objetivo a la brida del ocular (Figura 8). El otro estándar disponible es el Japanese Industrial Standard, o JIS. El estándar JIS tiene una distancia de 170mm de la brida del objetivo a la brida del ocular (Figura 9). Prestando atención a estas dos distancias es necesario cuando se escogen el objetivo y ocular adecuados para asegurar que la imagen proyectada del objetivo se visualiza adecuadamente a través del ocular. Aunque las distancias de la imagen son diferentes para DIN y JIS, no hay diferencia en rendimiento óptico; son iguales en calidad. Similarmente, cada estándar utiliza la misma rosca de montaje RMS de 0.7965” x 36TPI.

DIN y JIS se han utilizado históricamente al considerar un microscopio compuesto clásico. Algunos fabricantes de microscopios prefieren numerar la longitud del tubo de extensión por sus propiedades ópticas en vez de las mecánicas. Para un objetivo DIN estándar, esto cambia la longitud del tubo de extensión a 150mm ya que el ocular está formando la imagen del plano de imagen intermedio (Figura 8). Por último, existe una dimensión típicamente enumerada para objetivos que permite al usuario saber constantemente de qué longitud es: la distancia parafocal (PD). La distancia parafocal es la distancia de la brida del objetivo al objeto bajo inspección. Para los objetivos DIN esta distancia es estándar de 45mm y para JIS es de 36mm (Figuras 8 y 9).

DIN Standard
Figure 8: Estándar DIN
JIS Standard
Figura 9: Estándar JIS

 

Magnificación

Los oculares y objetivos ambos tienen magnificación que cada uno aporta a la magnificación total del sistema. La magnificación se indica generalmente con una X junto a un valor numérico. La mayoría de los objetivos contienen una banda de color alrededor de la circunferencia del cuerpo que indica su magnificación (Figura 7). Por ejemplo, una banda amarilla denota una magnificación de 10X.

Apertura Numérica

La Apertura Numérica (NA) de un objetivo es una función de la longitud focal y del diámetro de la pupila de entrada. Los objetivos con una apertura numérica (NA) grande a veces requieren de aceites de inmersión entre el objeto bajo inspección y el frente del objetivo. Esto se debe a que la NA más alta que se puede lograr dentro del aire es una NA de 1 (correspondiente al ángulo de 90 ° de luz). Para obtener un ángulo más amplio y aumentar la cantidad de luz entrando en el objetivo (Ecuación 2), es necesario utilizar aceite de inmersión (índice de refracción típicamente = 1.5) para cambiar el índice de refracción entre el objeto y el objetivo. Objetivos con NA alta en conjunto con aceite de inmersión son una simple alternativa a cambiar de objetivos, que puede ser más costoso.

Equation 2 (2)

Campo de Visión

El campo de visión es el área del objeto del cual el sistema de microscopio forma una imagen. El tamaño del campo de visión es determinado por la magnificación del objetivo. Cuando se utiliza un sistema ocular-objetivo, el campo de visión del objetivo es magnificado por el ocular para la observación. En un sistema cámara-objetivo, ese campo de visión es relevado al sensor de la cámara. El sensor en una cámara es rectangular y solo puede formar la imagen de una porción del campo de visión circular completo del objetivo. A diferencia de la retina en el ojo que puede formar la imagen de un área circular y captura el campo de visión completo. Es por esto que el campo de visión producido por un sistema de cámara-objetivo es usualmente un poco menor al de un sistema ocular-microscopio. Las Ecuaciones 3 y 4 pueden ser utilizadas para calcular el campo de visión de los sistemas mencionados.

Equation 3 (3)
Equation 4 (4)

Grosor del Cubreobjetos

Cuando se observan materiales fluidos tales como bacterias, cultivos celulares, sangre, etc., es necesario usar un cubreobjetos para proteger el objeto bajo inspección y los componentes del microscopio de la contaminación. Un cubreobjetos, o portaobjetos de microscopio de vidrio, cambia la manera que la luz refracta del objeto hacia el objetivo. Como resultado, el objetivo necesita hacer correcciones ópticas adecuadas para producir la mejor calidad de imagen. Es por esto que los objetivos indican un rango de grosores de cubreobjetos para los cuales son optimizados. Usualmente está enumerado después del símbolo de infinito (que indica que un objetivo es un conjugado infinito, o tiene un diseño de infinito corregido) y varía de cero (sin corrección para cubreobjetos) a 0.17mm.

Corrección de Calidad

La calidad de un objetivo y ocular determina el rendimiento del sistema. Además de escoger la magnificación y complejidad del diseño, entender la corrección de calidad correcta es extremadamente importante cuando se decide en el tipo de objetivo que se utilizará. La corrección de calidad (i.e. acromática, apocromática, plana, semi-plana) se indica en el objetivo en sí para permitir al usuario ver fácilmente el diseño del objetivo en cuestión. Existen típicamente dos niveles de corrección de la aberración cromática: acromático y apocromático. Los objetivos acromáticos se encuentran entre los objetivos más simples y más económicos. Están diseñados para corregir la aberración cromática en las longitudes de ondas rojas y azules, además de corregir la aberración esférica en la longitud de onda verde. Corrección limitada para aberración cromática y la falta de un campo de visión plano reducen el rendimiento del objetivo. Los objetivos apocromáticos, por el contrario, proporcionan una mayor precisión y son corregidos cromáticamente para el rojo, azul y amarillo. También proporcionan corrección de aberración esférica para dos a tres longitudes de onda y generalmente tienen una gran apertura numérica (NA) y una larga distancia de trabajo. Los objetivos apocromáticos son ideales para aplicaciones de luz blanca, mientras que los objetivos acromáticos son los más adecuados para la luz monocromática. Sin embargo, ambos diseños sufren significativamente de distorsión y curvatura de campo, que empeoran a medida que aumenta la magnificación del objetivo. Por lo tanto, siempre es importante enfocarse en el rendimiento del sistema completo, en lugar de sólo el rendimiento del objetivo por sí solo.

Los objetivos planos, también conocidos como semi-planos o micro-planos, corrigen la curvatura de campo. La curvatura de campo es un tipo de aberración presente cuando la imagen fuera del eje no puede ser enfocada en un plano de imagen plano, resultando en una imagen borrosa ya que se desvía del eje óptico. La Figura 10 ilustra la planitud del campo medida radialmente del centro en diseños de objetivos acromáticos, semi-planos y planos. Los objetivos acromáticos tienen un campo plano en el centro del 65% de la imagen. Los objetivos planos corrigen mejor en general y muestran mejor que el 90% del campo plano y en foco. Los objetivos semi-planos son intermedios a los otros dos tipos ya que el 80% del campo aparece plano.

Flat Field Correction
Figura 10: Corrección de Campo Plano: Acromático 65% (Izquierda) vs. Semi-Plano 80% (Centro) vs. Plano 90% (Derecha)

Conjugado Finito

En un diseño óptico de conjugado finito, la luz de una fuente (no en infinito) es enfocado a un punto (Figura 11). En el caso de un microscopio, la imagen del objeto bajo inspección es magnificada y proyectada en el ocular, o sensor si se utiliza una cámara. La distancia particular a través del sistema es caracterizada por el estándar DIN o JIS; todos los microscopios de conjugados finitos son cualquiera de estos dos estándares. Estos tipos de objetivos representan la mayoría de los microscopios básicos. Los diseños de conjugados finitos son utilizados en aplicaciones donde el costo y facilidad del diseño son las principales preocupaciones.

Simplified Finite Conjugate Microscope Design
Figura 11: Diseño Simplificado de Microscopio de Conjugado Finito

 

Conjugado Infinito (Corrección a Infinito)

En un diseño óptico de conjugado infinito, o de corrección a infinito, la fuente de luz es colocada al infinito y es enfocada a un punto pequeño. En un objetivo, el punto es el objeto bajo inspección y puntos infinitos hacia el ocular, o sensor si se utiliza una cámara (Figura 12). Este tipo de diseño moderno utiliza un tubo de extensión adicional entre el objeto y el ocular a fin de producir una imagen. Aunque este diseño es más complicado que el de conjugado finito, permite la introducción de componentes ópticos como filtros, polarizadores y divisores de haz al camino óptico. Como resultado, un análisis adicional y extrapolación de imágenes pueden realizarse en sistemas complejos. Por ejemplo, agregar un filtro entre el objetivo y el tubo de extensión permite observar una longitud de onda de luz específica o bloquear longitudes de onda no deseadas que de otra forma interferirían con la configuración. Aplicaciones de microscopía de fluorescencia utilizan este tipo de diseño. Otro beneficio de utilizar un diseño de conjugado infinito es la habilidad de variar la magnificación de acuerdo a las especificaciones necesarias de la aplicación. Ya que la magnificación de objetivo es la relación de la distancia focal del tubo de extensión a la longitud focal del objetivo (Ecuación 5), aumentando o disminuyendo la distancia focal del tubo de extensión cambia la magnificación del objetivo. Usualmente, el tubo de extensión es un lente acromático con una distancia focal de 200mm, pero otras distancias focales pueden ser sustituidas, personalizando así la magnificación total del sistema del microscopio. Si un objetivo es conjugado infinito, tendrá un símbolo de infinito localizado en el cuerpo del objetivo.

Simplified Infinite Conjugate Microscope Design
Figura 12: Diseño Simplificado de Microscopio de Conjugado Infinito (Corrección a Infinito)
Equation 5 (5)

EJEMPLOS DE APLICACIONES DE MICROSCOPÍA ÓPTICA

Para entender como los componentes de un microscopio pueden ser integrados con varios productos ópticos, de formación de imagen, o de fotónica, considera las siguientes aplicaciones de microscopía óptica: microscopia de fluorescencia y ablación láser. Cada uno utiliza su propia configuración única con el fin de trabajar con componentes de un microscopio.

Microscopía de Fluorescencia

Un fluoróforo (o tinte fluorescente) es utilizado para marcar proteínas, tejidos, y células para su examinación o estudio. Los fluoróforos pueden absorber luz de una longitud de onda y emitir (fluorescer) luz de otra longitud de onda. En una configuración de microscopía de fluorescencia común tres filtros son utilizados: un filtro de excitación, un filtro de emisión y un filtro dicroico. Cada fluoróforo tiene una banda de longitud de onda de absorción o excitación específica, el filtro de excitación solo transmitirá el rango específico de longitudes de onda. El fluoróforo, una vez que es excitado, emitirá en un rango diferente de longitudes de onda. El filtro de emisión transmite solo las longitudes de onda de emisión. El filtro dicroico que está diseñado específicamente para reflejar las longitudes de onda de emisión y transmite las longitudes de onda de excitación es utilizado para separar los canales de excitación y de emisión. La Figura 13 ilustra una configuración de formación de imagen de fluorescencia común. Para información adicional en microscopía de fluorescencia, consulte Fluoróforos y Filtros Ópticos para Microscopía de Fluorescencia.

Typical Fluorescence Microscope Setup
Figura 13: Configuración de Microscopio de Fluorescencia Común

Ablación Láser

Dos usos comunes de láseres son (1) calentar material sobre una base o (2) eliminar material de una base. Sistemas de ablación láser requieren componentes de microscopio ya que se requiere una manipulación precisa del haz (i.e. enfoque, doblar, reducción de dispersión, etc.). La configuración de ablación láser comúnmente contiene componentes ópticos personalizados, en lugar de componentes off-the-shelf, con el láser diseñado con precisión en el sistema (Figura 14). El láser está orientado en un diseño de epi-iluminacion para utilizar la capacidad del objetivo de microscopio para enfocar la luz en el plano del objeto, y de producir tamaños de punto extremadamente pequeños con aberraciones mínimas. Además, un ocular le permite al usuario ver dónde se encuentra el láser y asegurarse de que todo funcione correctamente. Los filtros son necesarios para evitar que el láser cause daños en el ojo del usuario. Las configuraciones de ablación láser se utilizan en aplicaciones médicas y biológicas, ya que ofrecen una mayor precisión que los métodos quirúrgicos convencionales.

Typical Laser Ablation Setup
Figura 14: Configuración de Ablación Láser Común

Los microscopios y objetivos son sistemas ópticos complejos con muchos usos. Ya no se utilizan únicamente para configuraciones biológicas (por ejemplo, observar las células de la mejilla en una clase de biología introductoria); más bien, pueden usarse para estudiar la longitud de onda de emisión de un fluoróforo, para analizar un defecto de 5μm en una parte mecanizada, para supervisar la ablación de material de una base, entre otras aplicaciones en la en las industrias de la óptica, la formación de imágenes y la fotónica. Entender la importancia de cada parte constitutiva de un microscopio y sus especificaciones permiten al usuario a elegir el mejor sistema y obtener los mejores resultados.

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